אנזימים הפועלים על קשר קרבוקסיל אסטר בארס נחשים

ארס נחשים מכיל אנזימים המעבירים הידרוליזה של קשרי קרבוקסיל אסטר.המצעים להידרוליזה הם פוספוליפידים, אצטילכולין ואצטט ארומטי.אנזימים אלה כוללים שלושה סוגים: פוספוליפאז, אצטילכולין אסטראז ואסטראז ארומטי.ארגינין אסטראז בארס נחשים יכול גם לבצע הידרוליזה של ארגינין או ליזין סינתטי, אך הוא מייקר בעיקר קשרי פפטיד חלבונים בטבע, ולכן הוא שייך לפרוטאז.האנזימים הנידונים כאן פועלים רק על מצעי אסטר ואינם יכולים לפעול על שום קשר פפטיד.בין האנזימים הללו, הפונקציות הביולוגיות של אצטילכולין אסטראז ופוספוליפאז חשובות יותר ונחקרו במלואן.לחלק מארסי נחשים יש פעילות אסטראז ארומטית חזקה, שיכולה לבצע הידרוליזה של p-nitrophenyl ethyl ester, a - או P-naphthalene acetate ואינדול אתיל אסטר.עדיין לא ידוע אם פעילות זו מיוצרת על ידי אנזים עצמאי או תופעת לוואי ידועה של carboxylesterase, שלא לדבר על המשמעות הביולוגית שלו.כאשר הארס של Agkistrodon halys Japonicus הגיב עם p-nitrophenyl ethyl ester ו-indole ethyl ester, ההידרוליזטים של p-nitrophenol ו-indole phenol לא נמצאו;להיפך, אם אסטרים אלה יגיבו עם תת-מין הנחשים של קוברה Zhoushan וארס נחשים Bungarus multicinctus, הם יעברו הידרוליזה במהירות.ידוע כי לארסלי קוברה אלו פעילות כולינסטראז חזקה, אשר עשויה להיות אחראית להידרוליזה של המצעים הנ"ל.למעשה, Mclean et al.(1971) דיווח כי ארסי נחשים רבים השייכים למשפחת הקוברה יכולים לבצע הידרוליזה של אינדול אתיל אסטר, נפתלין אתיל אסטר ובוטיל נפתלין אסטר.ארסי הנחשים הללו מגיעים מ: קוברה, קוברה שחורת צוואר, קוברה שחורה שפתיים, קוברה מוזהבת, קוברה מצרית, קוברה מלך, ממבה קוברה מוזהבת, ממבה שחורה וממבה לבנה שפתיים (ד.או עדיין מכיר את נחש רומבולה מזרחי

ארס הנחש יכול לבצע הידרוליזה של מתיל אינדול אתיל אסטר, שהוא המצע לקביעת פעילות הכולינסטראז בסרום, אך ארס נחש זה אינו מראה פעילות כולינסטראז.זה מראה שיש אסטראז לא ידוע בארס קוברה, השונה מכולינסטראז.כדי להבין את טיבו של אנזים זה, יש צורך בעבודת הפרדה נוספת.

1、 פוספוליפאז A2

(ט) סקירה כללית

פוספוליפאז הוא אנזים שיכול לבצע הידרוליזה של גליצריל פוספט.ישנם 5 סוגים של פוספוליפאז בטבע, כלומר פוספוליפאז A2 ופוספוליפאז

A. , phospholipase B, phospholipase C ו-phospholipase D. ארס הנחש מכיל בעיקר פוספוליפאז A2 (PLA2), כמה ארסי נחשים מכילים פוספוליפאז B, ופוספוליפאז אחרים נמצאים בעיקר ברקמות ובחיידקים של בעלי חיים.איור 3-11-4 מציג את אתר הפעולה של הפוספוליפאזות הללו בהידרוליזה של המצע.

בין פוספוליפאז, PLA2 נחקר יותר.זה עשוי להיות האנזים הנחקר ביותר בארס נחשים.המצע שלו הוא קשר האסטר על המיקום השני של Sn-3-glycerophosphate.אנזים זה נמצא באופן נרחב בארס נחשים, ארס דבורים, ארס עקרבים וברקמות בעלי חיים, ו-PLA2 קיים בשפע בארבעה ארסי נחשים ממשפחתם.מכיוון שהאנזים הזה שובר תאי דם אדומים וגורם להמוליזה, הוא נקרא גם "המוליזין".יש אנשים שקוראים גם לציטינאז המוליטי PLA2.

Ludeeke מצא לראשונה כי ארס נחשים יכול לייצר תרכובת המוליטית על ידי פעולה על לציטין באמצעות אנזימים.מאוחר יותר, Delezenne et al.הוכיח שכאשר ארס קוברה פועל על סרום או חלמון של סוסים, הוא יוצר חומר המוליטי.כיום ידוע כי PLA2 יכול לפעול ישירות על הפוספוליפידים של קרום האריתרוציטים, להרוס את המבנה של קרום האריתרוציטים ולגרום להמוליזה ישירה;זה יכול גם לפעול על סרום או לציטין נוסף לייצור לציטין המוליטי, הפועל על תאי דם אדומים לייצור המוליזה עקיפה.למרות ש-PLA2 קיים בשפע בארבע המשפחות של ארסי נחשים, תכולת האנזימים בארסי נחשים שונים מעט שונה.נחש רעשן (C

ארס נחשים הראה רק פעילות PLA2 חלשה.טבלה 3-11-11 ממחישה את ההשוואה של פעילות PLA2 של 10 ארסים עיקריים של נחשים ארסיים בסין.

טבלה 3-11-11 השוואה של פעילות פוספוליפאז VIII של 10 ארסי נחשים בסין

ארס של נחש

שחרור שומן

חומצה אליפטית,

Cjumol/mg)

פעילות המוליטית CHU50/^ גרם * מ"ל)

ארס של נחש

שחרר חומצות שומן

(^ראול/מ"ג)

פעילות המוליטית "(HU50/ftg * 1111)

Najanaja atra

9. 62

אחד עשר

Micracephal ofhis

חמש נקודה אחת אפס

קליספלאס

8. 68

אלפיים ושמונה מאות

gracilis

V, אקטוס

7. 56

* * #

אופיופגוס האנה

שלוש נקודה שמונה שתיים

מאה וארבעים

Bnugarus fasctatus

7,56

מאתיים ושמונים

B. multicinctus

נקודה תשע שש

מאתיים ושמונים

צפע א ראסלי

שבע נקודות אפס שלוש

T, mucrosquamatus

נקודה שמונה חמש

סיאמנסיס

T. Stejnegeri

0. 97

（2） הפרדה וטיהור

תכולת PLA2 בארס נחשים גדולה, והיא יציבה לחום, חומצה, אלקלי ודנטורנט, כך שקל לטהר ולהפריד את PLA2.השיטה המקובלת היא לבצע תחילה סינון ג'ל על הארס הגולמי, לאחר מכן לבצע כרומטוגרפיה של חילופי יונים, וניתן לחזור על השלב הבא.יש לציין כי ייבוש בהקפאה של PLA2 לאחר כרומטוגרפיה של חילופי יונים לא אמור לגרום לצבירה, מכיוון שתהליך הייבוש בהקפאה מגביר פעמים רבות את החוזק היוני במערכת, שהוא גורם חשוב הגורם לצבירה של PLA2.בנוסף לשיטות הכלליות לעיל, אומצו גם השיטות הבאות: ① Wells et al.② אנלוג המצע של PLA2 שימש כליגנד לכרומטוגרפיה זיקה.ליגנד זה יכול להיקשר ל-PLA2 בארס נחשים עם Ca2+.EDTA משמש בעיקר כמפלט.לאחר הסרת Ca2+, הזיקה בין PLA2 לליגנד יורדת, וניתן לנתק אותו מהליגנד.אחרים משתמשים בתמיסה אורגנית של 30% או 6מול/ליטר אוריאה בתור חומר eluent.③ כרומטוגרפיה הידרופוביה בוצעה עם PheiiylSephar0SeCL-4B כדי להסיר עקבות PLA2 בקרדיוטוקסין.④ נוגדן אנטי PLA2 שימש כליגנד לביצוע כרומטוגרפיית זיקה על PLA2.

עד כה טוהרו מספר רב של ארס נחשים PLAZ.טו ואח'.(1977) פירט את PLA2 שטוהר מארס נחשים לפני 1975. בשנים האחרונות דווח על מספר רב של מאמרים על הפרדה וטיהור של PLA2 מדי שנה.כאן, אנו מתמקדים בהפרדה ובטיהור של PLA על ידי חוקרים סינים.

צ'ן יואנקונג ואחרים.(1981) הפרידו שלושה מיני PLA2 מהארס של Agkistrodon halys Pallas בג'ה-ג'יאנג, שניתן לחלקו ל-PLA2 חומצי, נייטרלי ובסיסי לפי הנקודות האיזואלקטריות שלהם.על פי הרעילות שלו, PLA2 ניטרלי הוא רעיל יותר, אשר זוהה כרעלן עצבי פרה-סינפטי Agkistrodotoxin.PLA2 אלקליין פחות רעיל, ול-PLA2 חומצי אין כמעט רעילות.Wu Xiangfu et al.(1984) השוו את המאפיינים של שלושה PLA2s, כולל משקל מולקולרי, הרכב חומצות אמינו, N-טרמינל, נקודה איזואלקטרית, יציבות תרמית, פעילות האנזים, רעילות ופעילות המוליטית.התוצאות הראו שיש להם משקל מולקולרי ויציבות תרמית דומים, אך היו להם הבדלים משמעותיים בהיבטים אחרים.בהיבט של פעילות האנזים, פעילות האנזים החומצית הייתה גבוהה יותר מפעילות האנזים האלקליין;ההשפעה ההמוליטית של אנזים אלקליין על כדוריות דם אדומות של חולדה הייתה החזקה ביותר, ואחריה אנזים ניטרלי, ואנזים חומצי כמעט שלא הומליזה.לכן, משערים שהאפקט ההמוליטי של PLAZ קשור למטען של מולקולת PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) יצרו גבישי Agkistrodotoxin.טו גואנגליאנג וחב'.(1983) דיווחו כי PLA רעיל עם נקודה איזואלקטרית של 7. 6 בודד ומטוהר מהארס של Vipera rotundus מפוג'יאן, ותכונותיו הפיזיקליות והכימיות, הרכב חומצות האמינו והרצף של 22 שיירי חומצות אמינו ב-N -נקבעו.Li Yuesheng et al.(1985) בודדו וטיהרו PLA2 נוסף מהארס של Viper rotundus בפוג'יאן.תת-היחידה של PLA2 * היא 13,800, הנקודה האיזואלקטרית היא 10.4, והפעילות הספציפית היא 35/xnioI/miri mg。 עם לציטין כמצע, ה-pH האופטימלי של האנזים הוא 8.0 והטמפרטורה האופטימלית היא 65°C LD5 מוזרק לווריד בעכברים.זה 0.5 ± 0.12 מ"ג/ק"ג.לאנזים זה השפעות נוגדות קרישה והמוליטיות ברורות.מולקולת PLA2 הרעילה מורכבת מ-123 שיירים של 18 סוגים של חומצות אמינו.המולקולה עשירה בציסטאין (14), חומצה אספרטית (14) וגליצין (12), אך מכילה רק מתיונין אחד, וה-N-טרמינל שלה הוא שארית סרין.בהשוואה ל-PLA2 שבודד על ידי Tuguang, המשקל המולקולרי ומספר שיירי חומצות האמינו של שני האיזואנזימים דומים מאוד, וגם הרכב חומצות האמינו דומה מאוד, אך מספר שאריות החומצה האספרטית והפרולין שונה במקצת.ארס נחשי קוברה של גואנגשי מכיל PLA2 עשיר.Shu Yuyan et al.(1989) בודדו מהארס PLA2, בעל פעילות ספציפית גבוהה פי 3.6 מהארס המקורי, משקל מולקולרי של 13000, הרכב של 122 שיירי חומצות אמינו, נקודה איזואלקטרית של 8.9 ויציבות תרמית טובה.מהתבוננות במיקרוסקופ אלקטרונים של ההשפעה של PLA2 בסיסי על תאי דם אדומים, ניתן לראות שיש לו השפעה ברורה על קרום תאי הדם האדומים האנושיים, אך אין לו השפעה ברורה על תאי הדם האדומים של עיזים.ל-PLA2 זה יש אפקט פיגור ברור על המהירות האלקטרופורטית של תאי דם אדומים בבני אדם, עיזים, ארנבות וחזירי ניסיונות.חן וחב'.אנזים זה יכול לעכב את הצטברות הטסיות המושרה על ידי ADP, קולגן וחומצה ארכידונית נתרן.כאשר ריכוז PLA2 הוא 10/xg/ml~lOOjug/ml, צבירת טסיות הדם מעוכבת לחלוטין.אם טסיות שטופות שימשו כחומרים, PLA2 לא יכול היה לעכב הצטברות בריכוז של 20Mg/ml.אספירין הוא מעכב של cyclooxygenase, שיכול לעכב את ההשפעה של PLA2 על טסיות הדם.PLA2 עשוי לעכב אגרגציה של טסיות דם על ידי הידרוליזה של חומצה ארכידונית לסנתז טרומבוקסן A2.מבנה התמיסה של PLA2 המיוצר על ידי ארס Agkistrodon halys Pallas במחוז ג'ה-ג'יאנג נחקר באמצעות דיכרואיזם מעגלי, פלואורסצנטיות וספיגת UV.תוצאות הניסוי הראו כי מבנה השרשרת העיקרי של אנזים זה דומה לזו של אותו סוג של אנזים ממינים וזנים אחרים, למבנה השלד הייתה עמידות טובה לחום, והשינוי המבני בסביבת החומצה היה הפיך.השילוב של המפעיל Ca2+ואנזים אינו משפיע על סביבת שאריות הטריפטופן, בעוד המעכב Zn2+ עושה את ההיפך.האופן שבו ערך ה-pH של תמיסה משפיע על פעילות האנזים שונה מהריאגנטים לעיל.

בתהליך של טיהור PLA2 של ארס נחשים, תופעה ברורה היא שארס נחשים מכיל שניים או יותר פסגות elution PLA2.ניתן להסביר תופעה זו באופן הבא: ① עקב קיומם של איזוזימים;② סוג אחד של PLA2 מפולמר למגוון תערובות PLA2 עם משקלים מולקולריים שונים, רובם בטווח של 9,000~40,000;③ השילוב של PLA2 ורכיבי ארס נחשים אחרים מסבך את PLA2;④ מכיוון שהקשר האמיד ב-PLA2 עובר הידרוליזה, המטען משתנה.① ו- ② נפוצים, למעט חריגים בודדים בלבד, כגון PLA2 בארס נחשים CrWa/w

ישנם שני מצבים: ① ו-②.המצב השלישי נמצא ב-PLA2 בארס של הנחשים הבאים: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, פלסטיני צפע, צפע חול וק"מ נחש רעשן נורא.

התוצאה של מקרה ④ גורמת למהירות הנדידה של PLA2 להשתנות במהלך האלקטרופורזה, אך הרכב חומצות האמינו אינו משתנה.פפטידים יכולים להישבר על ידי הידרוליזה, אבל בדרך כלל הם עדיין קשורים זה לזה על ידי קשרי דיסולפיד.הארס של נחש הבור המזרחי מכיל שתי צורות של PLA2, הנקראות סוג a וסוג p PLA2 בהתאמה.ההבדל בין שני הסוגים הללו של PLA2 הוא רק חומצת אמינו אחת, כלומר, גלוטמין במולקולת PLA2 אחת מוחלף בחומצה גלוטמית במולקולת PLA2 האחרת.למרות שהסיבה המדויקת להבדל זה אינה ברורה, מקובל לחשוב שזה קשור לדימינציה של PLA2.אם PLA2 בארס הצפע הפלסטיני יוחמם עם הארס הגולמי, קבוצות הקצה במולקולות האנזים שלו יהפכו ליותר מבעבר.מ-C ל-PLA2 מבודד מארס נחשים יש שני N-טרמינלים שונים, ומשקלו המולקולרי הוא 30000. תופעה זו עלולה להיגרם מהדימר הא-סימטרי של PLA2, הדומה לדימר הסימטרי שנוצר על-ידי PLA2 בארס של נחש רעשן יהלום מזרחי ונחש רעשן יהלום מערבי.הקוברה האסייתית מורכבת מתת-מינים רבים, שחלקם אינם מוגדרים מאוד בסיווג.לדוגמה, מה שהיה מכונה בעבר תת-המין הקוברה הכספי החיצוני מוכר כיום

יש לייחס אותו לקוברה של הים הכספי החיצוני.מכיוון שישנם תת-מינים רבים והם מעורבבים יחדיו, הרכב ארס הנחשים משתנה מאוד עקב מקורות שונים, ותכולת האיזוזימים PLA2 גבוהה אף היא.למשל, ארס קוברה

לפחות 9 סוגים של איזוזימים PLA2 ממינים r ^ ll נמצאו, ו-7 סוגים של איזוזימים PLA2 נמצאו בארס של תת-מין הקוברה הכספי.דורקין וחב'.(1981) חקרו את תכולת ה-PLA2 ואת מספר האיזוזימים בארס נחשים שונים, כולל 18 ארסי קוברה, 3 ארסי ממבה, 5 ארסי צפע, 16 ארסי נחשי רעשן ו-3 ארסי נחשי ים.באופן כללי, פעילות ה-PLA2 של ארס הקוברה גבוהה, עם איזוזימים רבים.פעילות ה-PLA2 והאיזוזימים של ארס צפע הם בינוניים.פעילות PLA2 של ארס ממבה וארס רעשנים נמוכה מאוד או ללא פעילות PLA2.גם פעילות PLA2 של ארס נחשי ים נמוכה.

בשנים האחרונות לא דווח כי PLA2 בארס נחשים קיים בצורה של דימר פעיל, כמו נחש ה-Rhombophora המזרחי (ארס נחש C. מכיל סוג a וסוג P PLA2, שניהם מורכבים משתי יחידות משנה זהות. , ורק לדימראז יש

פעילות.Shen et al.הציע גם שרק הדימר של PLA2 של ארס הנחשים הוא הצורה הפעילה של האנזים.המחקר של המבנה המרחבי מוכיח גם ש-PLA2 של נחש רעשן יהלום מערבי קיים בצורה של דימר.מתחם דגים

ישנם שני PLA ^ Ei ו-E2 שונים של ארס נחשים, שבהם 仏 קיים בצורה של דימר, הדימר פעיל והמונומר המנותק שלו אינו פעיל.Lu Yinghua et al.(1980) חקרו עוד את התכונות הפיזיקליות והכימיות ואת קינטיקה התגובה של E. Jayanthi et al.(1989) בודדו PLA2 בסיסי (VRVPL-V) מארס הצפע.המשקל המולקולרי של המונומר PLA2 הוא 10000, בעל השפעות קטלניות, נוגדות קרישה ובצקות.האנזים יכול לפלמר פולימרים בעלי משקל מולקולרי שונה בתנאי של PH 4.8, ומידת הפילמור והמשקל המולקולרי של פולימרים עולים עם עליית הטמפרטורה.המשקל המולקולרי של הפולימר שנוצר ב-96 מעלות צלזיוס הוא 53,100, ופעילות ה-PLA2 של פולימר זה עולה בשניים